endotoksin - Эндотоксины Bacillus thuringiensis

Эндотоксины Bacillus thuringiensis

Bacillus thuringiensis — энтомопатогенный аэробный почвенный грамположительный микроорганизм, обладающий способностью в ходе споруляции образовывать кристаллоподобные включения, состоящие из энтомоцидных белков — дельта-эндотоксинов (также называемых Cry-белками). Кристаллы имеют бипирамидальную, кубическую или округлую форму и расположены в спорангии на противоположном по отношению к споре конце клетки.

В настоящее время описано более 60 подвидов Bacillus thuringiensis. Продуцируемые ими токсины различаются по специфичности энтомоцидного действия. Известны токсины, с высокой специфичностью убивающие отдельных представителей отрядов Lepidoptera(семейства Cry1 и Cry9), Coleoptera (семейство Cry3) и Diptera (семейства Cry4 и Cry11) на стадии личинки. Эндотоксины Cry2 обладают двойной специфичностью — для Lepidoptera и Diptera.

Большинство энтомоцидных белков имеют молекулярную массу 130-145 kDa (представители семейств Cry1, Cry4, Cry9 и др.). Попадая в кишечник насекомых, они подвергаются действию присутствующих там протеиназ, образуя устойчивые к дальнейшему протеолизу фрагменты 60-70 kDa — так называемые «истинные токсины». Для этих белков показана четко выраженная доменная структура. С-концевой район достаточно консервативен среди разных классов энтомоцидных белков. При протеолизе он легко деградирует путём отщепления небольших фрагментов с молекулярной массой 15-35 kDa, в свою очередь быстро подвергающихся дальнейшему гидролизу. N-концевой район (соответствующий «истинному токсину») относительно устойчив к протеолизу и гораздо более вариабелен у разных белков, нежели С-концевой район. Таким образом, исходные 130-145 kDa белки представляют собой протоксины, нуждающиеся в активации протеиназами кишечного сока насекомых.

Группа токсинов, к которой принадлежат представители семейств Cry2, Cry3, Cry10 и Cry11, включает в себя белки с молекулярной массой 60-70 kDa. По первичной структуре они напоминают N-концевые участки («истинные токсины») 130-145 kDa белков.

Доменная организация эндотоксинов

Методом рентгеноструктурного анализа третичная структура определена для двух энтомоцидных белков: дельта-эндотоксина Cry3Aа (67kDa), продуцируемого ssp. tenebrionis и «истинного токсина», соответствующего протоксину Cry1Aa (65kDa, ssp. kurstaki) (Groshulski, et al, 1995). Притом, что идентичность этих белков по аминокислотной последовательности составляет лишь 33%, их третичные структуры сходны. Выравнивание первичной структуры других эндотоксинов и расчет предполагаемой вторичной структуры позволяют предположить, что все они имеют принципиально сходную укладку полипептидной цепи.

Третичная структура молекулы «истинных токсинов» представлена тремя доменами (рис. 1).

s2 1 - Эндотоксины Bacillus thuringiensis
Рисунок 1. Третичная структура токсина Cry1aa.

Первый, N-концевой, построен из семи a-спиралей, при этом преимущественно гидрофобная пятая a-спираль окружена шестью амфифильными так, что гидрофобные поверхности последних повернуты к a5. Спирали a3 — a7 имеют достаточную длину (5-9 полных оборотов, более 30 А), чтобы пронизать бислойную клеточную мембрану. Наиболее длинная (45 А) спираль a6 содержит 9 полных оборотов (Grochulski et al., 1995).

Второй домен состоит из трех b-листов, сомкнутых так, что в сечении получается треугольник. Два первых b-листа состоят из четырех антипараллельных складок; третий — из трех b-складок и одной небольшой a-спирали (a8). В составе каждого b-листа между двумя внутренними нитями образуется петля. Эти петли собраны относительно близко друг к другу на вершине молекулы.

Третий домен представляет собой «сэндвич» из двух антипараллельных b-листов.

Несмотря на четко выраженную доменную структуру, в ходе денатурации молекула эндотоксина ведет себя как единое целое (Orth, et al, 1995). Эта целостность обеспечивается тесными междоменными контактами.

Наиболее сильные контакты обнаружены между первым и вторым доменами (площадь, занятая контактами составляет 1930 А2), несколько меньшая площадь контакта между доменами I и III (1180 A2). Во взаимодействиях этих доменов большую роль играют водородные связи и солевые мостики. Второй и третий домены контактируют достаточно небольшой поверхностью (910А2), и их связь обусловлена, в основном, гидрофобными взаимодействиями (Grochulski, et al.,1995).

Механизм действия эндотоксинов Bacillus thuringiensis

При попадании в кишечник насекомого белковый кристалл растворяется в щелочной среде кишечного сока (рН 9.5-10.5); растворенные протоксины активируются протеолитическими трипсино- и химотрипсиноподобными ферментами кишечника до «истинных токсинов» (рис.2).

s2 2 - Эндотоксины Bacillus thuringiensis
Рисунок 2. Механизм действия Cry-токсинов.
(a)- кристалл попадает в кишечник насекомого и растворяется; (b) — белок подвергается ферментативному гидролизу, образуется «истинный токсин»; (с) — II и III домены взаимодействуют с мембранным белком — рецептором; (d) — изменяется конформация I-го домена; (e) — несколько молекул токсина образуют в мембране пору или ионный канал.

Следующей стадией токсического воздействия является связывание «истинного токсина» с аффинным к нему белком (рецептором), экспонированным на поверхности апикальных мембран эпителиальных клеток кишечника. Связывание токсина с рецептором является обратимым (Hofmann, et al., 1986; Hofmann, et al., 1988).

На следующей стадии происходит необходимая перестройка конформации молекулы токсина с последующим внедрением некоторых из формирующих её структур в мембранный бислой. После этого связывание токсина с мембраной становится необратимым (Ihara, et al., 1993). Необходимость внедрения a-спиралей первого домена в мембрану чувствительной клетки для того, чтобы связывание стало необратимым, доказывается тем, что неполноценная молекула токсина, состоящая только из II-го и III-его доменов, связывается с мембраной только обратимо.

По всей видимости, одновременно с внедрением в мембрану происходит ассоциация нескольких молекул токсина (Masson et al,1999). Ансамбль трансмембранных участков, принадлежащих нескольким ассоциированным молекулам токсина, образует (в зависимости от конкретной пары токсин/мембрана) пору, или ионный канал. В первом случае (образование поры), происходит гибель клеток по механизму коллоидно-осмотического лизиса. Во втором, (образование ионного канала) — вследствие резкого изменения ионного состава и рН внутриклеточной среды.

Одним из методических подходов к изучению функциональной роли альфа-спиралей является синтез пептидов, идентичных по аминокислотному составу изучаемой спирали.

Синтетические пептиды, соответствующие пятой a-спирали I-го домена Сry1Ac и Cry3A способны образовывать каналы в фосфолипидных мембранах, и вызывать гемолиз эритроцитов. Видимо, гидрофобная спираль a5 обладает высоким сродством к фосфолипидным мембранам.

Иностранные авторы изучили взаимодействие между спиралями a-5 и a-7 в ходе их воздействия на мембрану. Они показали, что спираль a7 сама по себе не образует поры или канала, однако при совместном действии двух пептидов, соответствующих a-5 и a-7, канал в искусственных фосфолипидных мембранах образуется значительно эффективнее, чем при действии отдельного пептида, соответствующего a-5. Авторами работы этой предложена следующая модель (так называемая «модель зонтика») взаимодействия этих спиралей и образования поры в мембране клетки-мишени. После связывания второго домена с рецептором a7 оказывается наиболее приближенной к мембране, узнает ее и взаимодействует с липидным бислоем, являясь своего рода сенсором связывания. Затем пятая a-спираль, обладающая аффинностью к a7, приближается к лежащей на мембране седьмой спирали и пронизывает фосфолипидный бислой. Несколько молекул токсина собираются вместе так, что их пятые a-спирали выстилают пору, а седьмые лежат на поверхности мембраны, как спицы зонтика.

Подобную, но несколько отличающуюся модель предлагают для токсина Cry1Aa в своей работе Masson с соавторами. Согласно предполагаемой ими гипотезы, внутренность ионного канала выстилают четвертые альфа-спирали олигомера, состоящего из четырех молекул токсина. При этом ключевую роль в ион-транспортной активности канала, по мнению авторов, играет Asp136, находящийся внутри канала.

Также в этой работе рассмотрено участие в олигомеризации участков первого домена молекулы. По данным авторов, в объединении четырех молекул токсинов помимо второг и третьего домена играют существенную роль третья и шестая альфа-спирали первого домена. Согласно предложенной схеме, они расположены над поверхностью мембраны чувствительной клетки таким образом, что a6 одной молекулы токсина взаимодействует с a3 соседнего белка (Masson et al, 1999).

Другой гипотетический механизм образования поры в мембранах клеток — мишеней заключается в следующем. После взаимодействия воображаемых поверхностей, сформированных петлями второго домена, с рецептором, второй домен претерпевает определенные конформационные изменения, которые передаются на пару спиралей первого домена, скорее всего, a6 — a7, наиболее тесно взаимодействующих со вторым доменом. В результате передачи конформационного напряжения на первый домен, петли и шпильки, соединяющие a-спирали и расположенные ближе к мембране клетки-мишени, входят в липидный бислой. Это, в свою очередь, вызывает некоторые повреждения мембраны и следующую группу конформационных изменений первого домена, в результате которых его a-спирали, в первую очередь a5, пронзают мембрану и образуют пору. (Li, et al., 1991).

автор статьи: Кролик


Cписок использованной литературы:

  1. Grochulski P., L. Masson, S. Borisova, M. Pusztai-Carey, J.-L. Schwartz, R. Brousseau, M. Cygler, Bacillus thuringiensis Cry1Aa insecticidal toxin: crystal structure and channel formation, Journal of Molecular Biology, 1995, 254: 447-464.
  2. Orth P., Zalunin I.A., Gasparov V.S., Chestukhina G.G., Stepanov V.M., 1995, Journal of Protein Chemistry, 1995, 14: 241-249.
  3. Hofmann C., P. Luthy, Binding and activity of Bacillus thuringiensis delta-endotoxin to invertebrate cells, 1986, Arch. Microbiology, 146: 7-11.
  4. Hofmann C., P. Luthy, R. Hutter, V. Pliska, Binding of the delta-endotoxin from Bacillus thuringiensis to brush-border membrane membrane vesicles of the cabbage butterfly (Pieris brassicae), 1988, European Journal of Biochemistry, 173: 85-91.
  5. Ihara H., E. Kuroda, A. Wadano, M. Himeno, Specific toxicity of d-endotoxins from Bacillus thuringiensis to Bombyx mori, 1993, Bioscience, Biotechnology, Biochemistry, 57: 200-204.
  6. Masson L, Tabashnik BE, Liu YB, Brousseau R, Schwartz JL., Helix 4 of the Bacillus thuringiensis Cry1Aa toxin lines the lumen of the ion channel, Journal of Biological Chemistyr 1999 Nov 5;274(45):31996-2000
Понравилась статья? Поделиться с друзьями:
Добавить комментарий

;-) :| :x :twisted: :smile: :shock: :sad: :roll: :razz: :oops: :o :mrgreen: :lol: :idea: :grin: :evil: :cry: :cool: :arrow: :???: :?: :!: